siRNA設計サービス（siRNA合成をご注文いただける方は　この設計サービスは無料）

siRNAの設計をしてみたが自信がない、条件を満たす配列がない、設計をしてみてほしい、といった場合は、お問い合わせください。
弊社で独自に設計し、ご提案させていただいています。
Genbank の accession number 等と、その他ご存知の情報、ご希望(遺伝子の塩基多型情報や、マウスとヒトのターゲット遺伝子に
共通で使える配列、相同性のある遺伝子グループ内でターゲット遺伝子特異的な配列、といったもの)を、order@jbios.co.jp まで
お知らせください。

siRNA合成のご注文いただける方は　この設計は無料です。
この場合、実験結果を簡単にお知らせいただけると幸いです。
今後の設計の参考とさせていただきます。


こちらで弊社最新設計方法を公開しますので、参考にしてください。



siRNA設計方法

step１　スタートコドンから、75塩基以上下流の最初のAAを見つけます。
　　　　転写翻訳因子の結合部位を避ける狙いがあります。

step２　AAに続く19ヌクレオチドを記録する。
　　　　※AA(N19)でもかまいませんが、既に報告のあるsiRNA配列には、AAG(N18)が多くなっています。
　　　　　次に多いのが、AAC(N18)です。
　　　　　こちらのDr.Tusｃhlの項もご覧ください
　　　　　（N18）の下流のmRNA配列は、TT、TN、NT、AAである場合が多くなっています。
　　　　　siRNA配列周辺の上流、下流の12塩基程度は、GC含量が50%前後で、塩基配列に偏りのないものが多くなっています。


step３　AA-(N19)の配列のGCコンテンツが 50 % 前後であることを確認します。
        　　30 % 以下や 70 % 以上である場合は、さらに下流のAAを選択し、step２に戻る。
　　　　※40%前後を推奨しているオリゴ合成会社もあるようです。

※重要
siRNA設計のガイドラインが報告されました。
こちらに設計ソフトがあります。下記の論文にあるsiRNA設計ルールとの適合を評価できます。（2004年6月）
Biochem Biophys Res Commun. 2004 Jun 18;319(1):264-74.
Improved and automated prediction of effective siRNA.
Chalk AM, Wahlestedt C, Sonnhammer EL.

また、東京大学　程博士、西郷博士のグループの設計ソフトはこちら（siDirect http://design.rnai.jp/）です。
BLASTでは見つけることのできない、off-Targetを引き起こす可能性の高いsiRNA候補配列を、自動的に除くこともできるようです。（2004年5月）
siDirect: highly effective, target-specific siRNA design software for mammalian RNA interference.
Yuki Naito, Tomoyuki Yamada, Kumiko Ui-Tei, Shinichi Morishita and Kaoru Saigo
(2004). Nucleic Acids Res., (in press)
センス鎖の5'端をGまたはCに、3'端をAまたはTに、3'端側をATリッチにすると、RNAi効果のある可能性が高いようです。
Nucleic Acids Res. 2004 Feb 9;32(3):936-948.
Guidelines for the selection of highly effective siRNA sequences for mammalian and chick RNA interference.
Ui-Tei K, Naito Y, Takahashi F, Haraguchi T, Ohki-Hamazaki H, Juni A, Ueda R, Saigo K.
（2004年2月）

Biochem Biophys Res Commun. 2004 Apr 16;316(4):1050-8.
An algorithm for selection of functional siRNA sequences.
Amarzguioui M, Prydz H.
センス鎖の5'端をGまたはCに、3'端をAまたはTに、6塩基目をAに、3'端側をATリッチにし、GCコンテンツは32〜53%、
とすると、RNAi効果のある可能性が高いようです。（2004年4月）

Dharmacon社が発表した、こちらの論文も参考にしてください。本文中のTable I に、まとまっています。（2004年5月）
Nature Biotechnology 22, 326 - 330 (2004)
Rational siRNA design for RNA interference
Angela Reynolds, Devin Leake, Queta Boese, Stephen Scaringe, William S Marshall & Anastasia Khvorova

こちらの論文によれば、アンチセンス鎖の2番目の塩基がUであることが好ましいようです。（2005年7月）
Nat Biotechnol. 2005 Jul 17
Design of a genome-wide siRNA library using an artificial neural network.
Huesken D, Lange J, Mickanin C, Weiler J, Asselbergs F, Warner J, Meloon B, Engel S, Rosenberg A, Cohen D, Labow M, Reinhardt M, Natt F, Hall J.


siRNAとRISCの複合体の構造
Nature. 2004 May 20;429(6989):318-22.
生化学：PAZドメインによる突出部分特異的な低分子干渉RNA認識についての構造的基盤
Structural basis for overhang-specific small interfering RNA recognition by the PAZ domain
JIN-BIAO MA, KEQIONG YE & DINSHAW J. PATEL



step４　選択した21塩基をNCBI databaseのBLAST-searchにかけて、　配列が目的遺伝子に対して特異的であることを確認します。
　　　　他の遺伝子にも相同性がある場合は、さらに下流のAAを選択し、step２に戻ります。

※また、ＧまたはＣが3つ以上連続した配列は、特殊な立体構造をとるため避けてください。
(ただし、実際にはGが４つ連続した配列のオリゴにも、RNAi効果のある例があります。）
※polymorphismのある配列は避けてください。1塩基のミスマッチがあっても、siRNAの効果は弱くなります。


※ホモロジーサーチの結果は、ssearchの方がBLASTよりも正確のようです。ただしssearchは、結果が出るまでに時間がかかるようです。
どちらもお試しください。（2004年5月）

※注意※ターゲット遺伝子の発現抑制とは独立に、19塩基中11塩基以上の相同性がある遺伝子群の発現が、
30％から50％程度抑制される可能性があるようです。
BLASTサーチをした後のsiRNA選択を、より厳しくしたほうがよいようです。（2003年12月）
Nat Biotechnol. 2003 Jun;21(6):635-7.
Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi.
Jackson AL, Bartz SR, Schelter J, Kobayashi SV, Burchard J, Mao M, Li B, Cavet G, Linsley PS.
また、siRNAの投与によってターゲットと異なる予期せぬ遺伝子の発現が抑制され、表現形が変化してしまう可能性も否定できません。
よって、1つのターゲット遺伝子に対して、異なる部位に対する配列のsiRNAを用いて、同様の表現形の変化があることを確認することも必要になります。（2003年12月）

in vitroの実験では、siRNAの中央部11塩基程度がmRNAの配列と一致すれば、RISC複合体がmRNAを切断するようです。
よってoff-Targetを全く起こさないsiRNAの設計は、難しいことがあります。（2004年6月）
Nat Struct Mol Biol. 2004 May 30
Kinetic analysis of the RNAi enzyme complex.
Haley B, Zamore PD.

すでに効果の知られているsiRNAにも、off-Target発現抑制活性があるという警告の論文です。
将来は、厳密な証明のために、1つのターゲット遺伝子に対して、
複数のsiRNAで実験し、同様の表現形の変化があることを見せることが、要求されるかもしれません。
あるいはDNAチップなどを用いて、ターゲット以外の重要な遺伝子に、off-Target抑制が起こっていないことを、
証明する必要が出てくるかもしれません（2004年6月）
Biochem Biophys Res Commun. 2004 Jun 18;319(1):256-63.
Many commonly used siRNAs risk off-target activity.
Snove O Jr, Holen T.

ｍRNA
AUG−−−−−AAGGACACGUGCUACUAGAUUUC−−−−−−−−−−
　　　　　75塩基以上 下流　　　　　　（配列例）
　　　　　　　　　　↓
siRNA              5'-GGACACGUGCUACUAGAUU dTdT-3'　（センス鎖）
               3'-dTdT CCUGUGCACGAUGAUCUAA-5'　（アンチセンス鎖、こちらの鎖がmRNAとアニーリングして機能する）

上記の場合のsiRNAの注文は、
a, GGACACGUGCUACUAGAUUTT
b, AAUCUAGUAGCACGUGUCCTT
となります。

※ご注文の際は、必ずセンス鎖とアンチセンス鎖の両方の配列を明記してください。
（5'から3'の順に書く。3'側に”TT”を付け加える。）
ご注文の配列が直接合成機に入力され、合成が開始されます。