siRNA設計サービス（siRNA合成をご注文いただける方は　無料）

siRNAの設計をしてみたが自信がない、条件を満たす配列がない、設計をしてみてほしい、といった場合は、お問い合わせください。
弊社で独自に設計し、ご提案させていただいています。

Genbank の accession number 等と、その他ご存知の情報、ご希望(遺伝子の塩基多型情報や、マウスとヒトのターゲット遺伝子に
共通で使える配列、相同性のある遺伝子グループ内でターゲット遺伝子特異的な配列、といったもの)を、tech@jbios.co.jp まで
お知らせください。

siRNA合成のご注文いただける方は　この設計は無料です。
この場合、実験結果を簡単にお知らせいただけると幸いです。
今後の設計の参考とさせていただきます。

こちらで弊社最新設計方法を公開しますので、参考にしてください。


siRNA設計方法

step１　スタートコドンから、75塩基以上下流の最初のAAを見つけます。
　　　　転写翻訳因子の結合部位を避ける狙いがあります。

step２　AAに続く19ヌクレオチドを記録する。
　　　　※AA(N19)でもかまいませんが、既に報告のあるsiRNA配列には、AAG(N18)が多くなっています。
　　　　　次に多いのが、AAC(N18)です。
　　　　　（N18）の下流のmRNA配列は、TT、TN、NT、AAである場合が多くなっています。
　　　　　siRNA配列周辺の上流、下流の12塩基程度は、GC含量が50%前後で、塩基配列に偏りのないものが多くなっています。

step３　AA-(N19)の配列のGCコンテンツが 50 % 前後であることを確認します。
        　　30 % 以下や 70 % 以上である場合は、さらに下流のAAを選択し、step２に戻る。
　　　　※40%前後を推奨しているオリゴ合成会社もあるようです。

※重要
東京大学　程博士、西郷博士のグループの設計ソフトはこちら（siDirect (rnai.jp)）です。
BLASTでは見つけることのできない、off-Targetを引き起こす可能性の高いsiRNA候補配列を、自動的に除くこともできるようです。（2004年5月）
siDirect: highly effective, target-specific siRNA design software for mammalian RNA interference.
Yuki Naito, Tomoyuki Yamada, Kumiko Ui-Tei, Shinichi Morishita and Kaoru Saigo
(2004). Nucleic Acids Res., (in press)
センス鎖の5'端をGまたはCに、3'端をAまたはTに、3'端側をATリッチにすると、RNAi効果のある可能性が高いようです。

センス鎖の5'端をGまたはCに、3'端をAまたはTに、6塩基目をAに、3'端側をATリッチにし、GCコンテンツは32〜53%、
とすると、RNAi効果のある可能性が高いようです。
こちらの論文によれば、アンチセンス鎖の2番目の塩基がUであることが好ましいようです。

step４　選択した21塩基をNCBI databaseのBLAST-searchにかけて、　配列が目的遺伝子に対して特異的であることを確認します。
　　　　他の遺伝子にも相同性がある場合は、さらに下流のAAを選択し、step２に戻ります。

※また、ＧまたはＣが3つ以上連続した配列は、特殊な立体構造をとるため避けてください。
(ただし、実際にはGが４つ連続した配列のオリゴにも、RNAi効果のある例があります。）
※polymorphismのある配列は避けてください。1塩基のミスマッチがあっても、siRNAの効果は弱くなります。


※注意※ターゲット遺伝子の発現抑制とは独立に、19塩基中11塩基以上の相同性がある遺伝子群の発現が、
30％から50％程度抑制される可能性があるようです。
BLASTサーチをした後のsiRNA選択を、より厳しくしたほうがよいようです。

また、siRNAの投与によってターゲットと異なる予期せぬ遺伝子の発現が抑制され、表現形が変化してしまう可能性も否定できません。
よって、1つのターゲット遺伝子に対して、異なる部位に対する配列のsiRNAを用いて、同様の表現形の変化があることを確認することも必要になります。
in vitroの実験では、siRNAの中央部11塩基程度がmRNAの配列と一致すれば、RISC複合体がmRNAを切断するようです。
よってoff-Targetを全く起こさないsiRNAの設計は、難しいことがあります。

すでに効果の知られているsiRNAにも、off-Target発現抑制活性があるという警告されています。
将来は、厳密な証明のために、1つのターゲット遺伝子に対して、複数のsiRNAで実験し、同様の表現形の変化があることを見せることが、要求されております。
あるいはDNAチップなどを用いて、ターゲット以外の重要な遺伝子に、off-Target抑制が起こっていないことを、証明する必要が出てくるかもしれません

ｍRNA
AUG−−−−−AAGGACACGUGCUACUAGAUUUC−−−−−−−−−−
　　　　　75塩基以上 下流　　　　　　（配列例）
　　　　　　　　　　↓
siRNA              5'-GGACACGUGCUACUAGAUU dTdT-3'　（センス鎖）
               3'-dTdT CCUGUGCACGAUGAUCUAA-5'　（アンチセンス鎖、こちらの鎖がmRNAとアニーリングして機能する）

上記の場合のsiRNAの注文は、
sense 5'- GGACACGUGCUACUAGAUUTT-3'
antisense5'- AAUCUAGUAGCACGUGUCCTT-3'
となります。

※ご注文の際は、必ずセンス鎖とアンチセンス鎖の両方の配列を明記してください。
（5'→3'の順に書く。3'側にオーバーハング”TT”を付け加える。）
※配列はお間違いないようご注意ください。
※精製方法（カラム精製orHPLC精製）のご指定およびアニーリングが必要な場合ははその旨お知らせください。