DNA RNA の受託合成、プロテオーム受託解析、ペプチド抗体作製
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接着性細胞のsiRNAトランスフェクション方法　　　（浮遊性細胞用プロトコールはこちら）


1, 細胞のプレーティング
トランスフェクションをする１日前に、細胞を3.5cmプレートにまく。
細胞量は20-50%コンフルエントになるようにする。
37℃、5%CO2で一晩培養する。

2, oligo dilutionの調製
20μMのアニーリングしたオリゴ10μlを170μlのOpti-MEM mediumで希釈する。

3, transfection Reagentの調製
4μlのOligofectAMINE(Invitrogen社)を16μlのOpti-MEM mediumで希釈する。
室温で5分から10分間静置する。

4, oligo dilutionをtransfection Reagentに加え、軽く混合する。ボルテックス禁止。
室温で15分から20分間静置する。

5, 細胞をOpti-MEMで洗った後、Opti-MEMを800μl加える。

6, 4のTransfection mixtureを細胞に加え（Total 1ml）軽く混合する。
（siRNA最終濃度は200nM。20nM程度でも同等の効果が得られる場合があります。）

7, 37℃、5%CO2で4時間培養後、血清を300μl加える。

8, 2から4日目に細胞を回収し、目的遺伝子の発現をウエスタンやRT-PCRで調べる。
（一般には、24時間後から72時間後に最も強く発現の抑制がかかります。
注意：遺伝子発現抑制効果は、トランスフェクションの2日後から1週間程度継続します。
さらに長期間RNAiを行いたい場合は、siRNAのトランスフェクションを繰り返すか、siRNA様遺伝子の発現ベクターを培養細胞に
stable transfectionする方法があります。
後者の実験の際、アダプターDNAのベクターへのクローニングには、５’リン酸化オリゴをお試しください。
クローニング効率が上昇します。）

※細胞内でsiRNAを発現するベクターも現在購入できるようです。（2002年11月）
pSilencer 1.0-U6（U6プロモーターあり、薬剤耐性マーカーなし、Ambion社）。
pSUPER（H1プロモーターあり、薬剤耐性マーカーなし、OligoEngine社）など。