DNA RNA の受託合成、プロテオーム受託解析、ペプチド抗体作製
　バイオ研究を支援する

siRNAアニーリング法

※実験にはRNAase free の水およびバッファーを使用してください。
RNAaseの混入を避けるため、チップ及びチューブは、オートクレーブ処理したものではなく、新品のチップ及びチューブのパッケージから、
手袋を使って取り出したものを使用してください。

1. RNAサンプルをそれぞれ50μM（50pmol/μl）に希釈する。
乾固したＲＮＡは、DNAと違って水に溶けにくい性質があります。ボルテックスミキサーや超音波洗浄機を使って、時間をかけて溶かしてください。
RNAase-freeの条件であれば、溶解は室温でも良いですが、RNAaseの混入の恐れがある場合は、チューブを氷につけて冷却しながら溶かす
（温めた方が溶けやすいですが、それだけ分解の恐れが高くなります）。透明な浮遊物が、ほとんどなくなるまで溶かす。
※カラム精製品には、カラムから脱落した浮遊物が混入してしまう場合があります。軽く遠心して、白い浮遊物は取り除いてご使用ください。
※実験に使用する前日に一度凍結し、当日融解すると溶けやすくなるかもしれません。

2. RNAサンプルを30μlずつと5×annealing buffer
(500 mM potassium acetate, 150 mM HEPES-KOH pH 7.4, 10 mM magnesium acetate) 15μlを混合する（Total75μl）
残ったRNAのうち長期間使わない分は、小分けにして乾燥し、-80℃で保存する。
１、２週間以内に使用する分は、溶解したまま-20℃で保存する。

3. 溶液を90℃で1分間加熱し、スピンダウン後に37℃60分間静置する。オリゴは２本鎖になり、最終濃度は20μM（20pmol/μl）になる。
　溶液は-20℃で保存し、アニーリング後の凍結融解は5回以内にする。

（参考）siRNA user guide

5×annealing bufferの調製方法

5×annealing buffer (500 mM potassium acetate, 150 mM HEPES-KOH pH 7.4, 10 mM magnesium acetate)の調製方法

水　25ml
1M potassium acetate 50ml
1M HEPES-KOH pH7.4 15ml
100mM magnesium acetate 10ml

を混合し、DEPCを100μl加えてから、スターラーでよく混合し（DEPCは有毒で揮発性が高いので、混合中はふたをすること）、
DEPCを不活化するために、オートクレーブする（オートクレーブの際はふたをゆるめる）。

Trisには細胞毒性があるため、HEPESが使われている。