DNA,RNA合成報告書について
                                                                     

製品にはDNA合成報告書が添付されます｡
合成報告書には，DNA収量（OD値，モル数），Tm値，核酸部分の分子量などのデータを記載されています｡

計算式は，以下の通りです。
（核酸）分子量 ＝（ NA × 313.2 ）＋（ NC × 289.2 ) ＋（ NG × 329.2 ）＋（ NT × 304.2 ）− 61.9
 ※ NA， NC， NG， NT ： A，C，G，T それぞれの塩基数，
 ミックス塩基は，それぞれの平均分子量を用いています。
イノシン（分子量 314.2），ウリジン（分子量 290.2），RNA にも対応。

Tm値 の計算方式はここを参照ください。

モル数 （ ｐM ）： [ OD値 ] × 33 （μg）／ [ 核酸分子量 × 1000000 ]

※ ただし，合成産物の純度は，100 ％ と仮定した値です。
（ カラム精製品の純度は，通常 90 ％前後です 。）
※ ５’標識，３’標識分の分子量は含んでいません。
厳密には　各標識にもそれぞれ　固有の吸光がありますので　測定した吸光度には　その影響があるのですが　通常一定の長さのオリゴの場合オリゴ部分の吸光が十分に高いので　その影響を除外して計算しています。鎖長が短いときは　考慮する必要があります。

又　合成報告書に表記した塩基配列は　ＤＮＡ合成機から直接出力したものです。製品到着時に　必ず配列をご確認ください。
但し　イノシンは　「５」で　ウリジンは　「６」で　それぞれ表記しています。

Ｓ化オリゴは　小文字で表記しています。

５’標識　３’標識等は　手書きで表記されています。

合成品は　精製に使用した溶出溶媒をエバポレータで飛ばして　乾固させてお届けしております。その乾燥過程で　最終製品が　ペレット状、フレーク状等　多様な形態となることがあります。溶解してお使いください。基本的には　水溶性は高いのですが　配列組成によって　ボルテックス等による手順が必要なときがあります。

TOF-MS分析データの見方について

MALDI TOF-MS質量分析によって　　目的オリゴの分子量の正確な確認が可能となります。　短鎖長の合成不良オリゴの存非や、塩基欠失オリゴ
の混入の検出等が確実に実施できます。
通常　鎖長が４０塩基を超えるオリゴでは　イオン化しにくいので　測定不能とさせていただいております。

TOF-MSによる質量分析チャートの見方

目的オリゴのピーク

オリゴDNA RNAの場合、目的オリゴに+Hイオン化されたピークが読みとられるのですが、目的オリゴのピークが　必ずしも正確に目的
分子量ではなく　数Ｄａ違っていることがあります。
コントロール測定によるキャリブレーションで一定の補正が可能ですが　試料ホルダーでのサンプルのプロット位置等　測定誤差が発生することは
避けられません。
又　炭素原子の安定同位体13Ｃの存在（同位体存在度=1.1%)も　含まれる炭素原子数の違いも無視できない値となり　波動の原因となります。

目的オリゴのピーク以外に　検出されるピークについて　以下のようなピークが測定されます。
塩付加ピーク

目的物に　+Na（＋23n) +K(+39n)等の塩が付加されたサブピークが　目的ピーク近辺に見られることがあります。
測定サンプルは　測定前に十分な脱塩処理を実施していますが　配列条件（たとえば　ＧＣリッチな配列）等によって　どうしても
塩付加が避けられないことがあります。

多価イオンピーク

目的オリゴに　２価や３価のイオンが付加されたピークが　目的分子量の１／２、１／３　の位置に見られることがあります。
これらのピークは　目的オリゴのものと判断されます。

多量体ピーク

目的物が２量体や３量体となったものに　１価のイオンが付加された時　目的分子量の２×　又は　３×　の位置に多量体ピークが
見られることがあります。特に自己相補性の高い配列の場合　よく見られます。　これも　目的オリゴのものと判断されます。

脱プリンピーク

MALDI(マトリックス支援レーザー脱離イオン化）法を利用しておりますので TOF-MS装置では　紫外線レーザーを試料に照射します。しかし　これに
よって、オリゴの一部の分解が進むことがあります。具体的には、A及びG塩基のプリン環が壊れる脱プリンという現象が見られます。
Ａでは-115〜134Da  G -134〜150Da 短くなったサブピークが現れます。塩基長が長くなったり、イオン化しにくいオリゴ たとえばＧリッチ
なオリゴではレーザ強度を高めて　飛ばす必要がありますが　その場合 このような現象が　時に見られます。
この脱プリン現象は　オリゴの酸化等でも　実際にも起きるもの（abasic site)ですので　このように解析の過程で起きたartifactなものと残念ながら　区別が
できません。
この脱プリンと同様に　レーザー照射によって　分解現象が起きる修飾製品もあります。（例　BHQ修飾）

短鎖長ピーク

オリゴ合成は通常　３’末端から１塩基ずつ合成を積み上げていきます。１塩基ごとのカップリング（反応）収率は　９９％程度とされています。
従って　目的物以外に　鎖長の短いオリゴが副生され　そのようなピークが検出されます。通常　精製によってこれらの不純物、短鎖長オリゴを除くのですが　
残念ながら　排除できなかったものが残ることがあります。これら不純物をできる限り　少なくなるよう　努力しております。

TOF-MSデータに定量性のない理由

測定可能とされる　４０塩基以下の長さのものでも　鎖長の長いものほど　やはりイオン化しにくいので　チャート上のピークの割合が、その成分割合
を示しているわけではなく　イオン化しやすい短いピークが実際より多く見えます）不純物の混合割合やオリゴの純度等の定量的な分析
には残念ながら　使用できません。
必要に応じて　ＨＰＬＣ分析、PAGE分析により、TOF-MS分析では確認が難しい定量的な分析を補完する必要があります。

当社MALDI TOF-MS使用機器及び測定条件について

使用機器：　AB SCIEX社　VoyagerDE　PRO

通常測定では　以下の　TOF-MS測定条件によって　実施しております。    

    Negative mode

　　Matrixの組成：
　　　   3HPA(50mg/ml in DW)：ammonium citrateクエン酸アンモニウム（50mg/ml)＝９：１ 

　　サンプルの濃度とmatrixの濃度（混合率）：
　　　　サンプル濃度（0.5ug/ml in DW）：matrixの濃度（上記）＝1 ：　1