バイオ研究を支援する
DNA RNA の受託合成、プロテオーム受託解析、ペプチド抗体作製
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相互作用 タンパク質同定 |
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「相互作用タンパク質同定」受託サービス
タンパク質複合体の解明はタンパク質の機能の理解の為に大変重要で 相互作用たんぱく質の同定に
特化した２つの解析技術を提供します。
アプローチ１ アフィニティカラムを使った新規相互作用タンパク質の同定
アプローチ２ 誘導発現ヒト細胞樹立と相互作用タンパク質の同定
アプローチ１ アフィニティカラムを使った新規相互作用タンパク質の同定
タンパク質間の相互作用は特定のドメインやモチーフを介して行われます。これらを含む領域を組換え
タンパク質として作り、アフィニティーカラムを作成し充分な量の細胞エキストラクトを用いたアフニティ
精製をおこなうことでその領域に結合するタンパク質を効率よく分離し、質量分析により同定することが
出来ます。この方法は強制発現が細胞にToxicなタンパク質、弱い相互作用や相互作用タンパク質の
細胞内分子数の少ない場合、あるいは膜結合タンパク質などの免疫沈降の困難なタンパク質を、細胞
エキストラクトが取れれば、どのような細胞からも、効率よく決定する事が出来、同時に結合ドメイン
も同定出来ます。既に多くの相互作用タンパク質が知られている著名なタンパク質からも新規の
結合タンパク質の同定が期待できます。弊社ではこの技術を最適化し、お望みのタンパク質の全体
あるいはそれぞれの領域に結合する新規の結合タンパク質を得る研究をサポートいたします。
＊弊社のこの技術を利用した最近の論文の例では、BRCA1/BARD1複合体への新規結合タンパク質を同定し、
その機能の解明を行なった
Matsuzawa A. et al. Mol Cell 2013 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24289923)をご参照下さい。
サービス概要と価格・納期
このサービスは以下のいずれのステップからでも申し受けます。ご相談をしながらお望みのタンパク質のそれぞれ
の領域に結合するタンパク質の同定をサポートします。
１ バイトたんぱく質に関する情報とcDNAをお送りください。
独自の検索技術を用いてドメイン検索を行い、どの領域をバイトに使えばいいか提案させていただきます。
その結果に従って、タンパク質を大腸菌でGST融合タンパク質として発現させるプラズミドを作成し発現させ、
精製いたします。
発現させるタンパク質の部分領域当り 7万円（税別）
２ 細胞の培養とエキストラクトの準備
（ヒト細胞株HeLa, U2OS, 293等は常時利用出来ます。他の細胞はお送り下さい） ５万円（税別）
４ nanoLC-MS/MSによるタンパク質の同定：
SDS PAGEの結果をお知らせして、どのバンドを決定するかをご相談いたします。
解析バンド当たり ６万円(税別）
但、そのバンドに新規の結合タンパク質が含まれなかった場合は 解析バンド当たり３万円（税別）
に値引きします。
新規の結合タンパク質かどうかの判定は BioGRID (http://thebiogrid.org) に掲載されているかで判断
させていただきます。
nanoLC-MS/MSによるたんぱく質同定の詳細な内容は nanoLC-MS/MSタンパク質同定サービスを
参照ください。
標準納期：１か月
たんぱく質の発現に困難がある場合には発現ベクターを変えたりしますので、これ以上の時間が
掛かる場合があります。
ご注文の手順
１）メールの送信
アフィニティカラムを使った相互作用タンパク質の同定サービスをご照会またはご注文いただくとき
メールをご送信ください。
送信先メールアドレス pro@jbios.co.jp
| メールで連絡していただきたい事項 １ ご注文者（研究機関名、所属、氏名、住所、電話番号、メールアドレス） ２ サポートを希望される内容（ご希望を記入ください） ３ ご送付いただく cDNAに関する情報 その他 ご希望またはご質問があれば お知らせください。 ４請求先（請求書宛名、請求送付先住所 所属 氏名、担当者名、 その他の特別の指示事項） |
２）メールの返信 ご照会またはご依頼いただきましたメールの内容に応じて解析手法に関して当社での検討
を行います。必要に応じて打ち合わせをさせていただいた上で解析の諾否を連絡させていただきます。
３）cDNAの送付方法
送付いただくcDNA（量は1マイクログラム以上）は 大腸菌ではなく cDNAの入ったプラズミドをお送り
ください。
サンプルをクール便（4℃、着払い）で下記の住所までお送りください。
サンプル送付先：
〒９８０－８５７９宮城県仙台市青葉区荒巻字青葉６－６－４０
株式会社日本プロテオミクス 宛
電話 ０２２ー３４２－１７４２
発送していただきましたら、メールにてお知らせください。
トラブルを避けるため 平日の着荷でお願いいたします。
アプローチ２ 誘導発現ヒト細胞樹立と相互作用タンパク質の同定
ヒト細胞の中での相互作用タンパク質の同定には、タグ付き安定発現細胞株を樹立、タグに対する
抗体で免疫沈降させた相互作用タンパク質をnanoLC-MS/MS質量分析装置で同定するのが最も確実で
強力な手法です。
しかし 遺伝子によっては このような安定発現細胞株の樹立に困難が伴うことが多いことも事実
です。当社の技術は 既に多くの研究者の信頼を得ていて、その成果は最先端の学術雑誌に掲載
されています。
最近の論文の例では、EMBO J 30, 130-144, 2011, や Nat G enet 44, 593-597, 2012 を
ご参照下さい。
サービス概要と価格・納期
１ cDNAをお送り下さい。5’-タグあるいは 3’-FLAGタグを付けたTet-‐誘導発現
コンストラクトの２種類を作成いたします。
細胞樹立に進まれる場合は発現コンストラクトの作成は無料
cDNAのシークエンス確認は1万円/1kb
２ それを用いてFlp-In遺伝子導入系で、発現が一様で、種々の条件でのタンパク質複合体解析に適した
ヒト細胞株（ヒト腎細胞由来HEK293）の樹立を試みて 1種類の細胞樹立を保証いたします。
細胞樹立 ３５万円（税別）
樹立した細胞は提供させていただきます。
細胞樹立出来なかった場合は無料とさせていただきます。
２’遺伝子によっては、その細胞毒性のために発現細胞の樹立が出来ない場合があります。その場合
には、定常低発現コンストラクトを使って一過性発現を行ないます。
5’‐FLAGおよび3’‐FLAGの２種の発現 ３０万円（税別）
３ 発現した細胞の中で、5’-‐FLAG及び3’-‐FLAGの一株づつを必要な培養条件で培養し、相互作用
するタンパク質を核及び細胞質に分けて FLAGタグに対する抗体カラムで免疫沈降し、FLAGペプチド
で溶出して、ゲルに展開させ タンパク質のバンドをベクターのみを発現するコントロール細胞と比較
したゲル画像を作成、送付いたします。
細胞培養と免疫沈降 １０万円／一株（税別）
４ nanoLC-MS/MSによる質量分析でバンド毎にタンパク質を同定します。 6万円／一本（税別）
詳細な内容は nanoLC-MS/MSタンパク質同定サービス を参照ください。
標準納期： 3ヶ月
タンパク質によっては 細胞の樹立及び一定の細胞数の増殖までに時間を要する場合もあります。
作業の進行状況は 定期的に報告させていただき 日程の延長が必要とみられる場合には 改めて
相談させていただきます。
当社の技術の特徴
定常および誘導発現細胞株樹立とヒト細胞内タンパク質複合体解析の豊富な経験があり タンパク質
複合体解析に適合した 以下のような技術を保有しております。これらの技術を組み合わせて 発現
目的のタンパク質に適合する定常低発現および 誘導発現細胞を樹立いたします。
１ Flp-In Expression System による安定した遺伝子の導入技術
発現目的の遺伝子がヒト細胞の核DNAにランダムに複数個挿入されることを避けて、1コピーのみが特定
の位置に導入され 発現量を一定化することがタンパク質の複合体解析には重要です。
（ライセンス保有）当社は Salk Institute からFlp-In Expression System に関わるFLP Technology
のライセンスを受けております。
２ 複合体同定に適した定常低発現のプロモーターの開発
外から導入した遺伝子を高発現させると頻繁に細胞増殖阻害効果が生じます。また、相互作用する発現量
の少ないタンパク質を同定するためには 導入した遺伝子を出来る限り低発現させ、相互作用するたんぱく
分子を増やすことが重要です。しかし同時に、膨大な細胞数を扱うこともできないので その発現量は
免疫沈降の実験を可能にするレベルが必要です。この目的のために当社では CMVプロモーター配列に大幅
な欠失を入れ、元のCMVプロモーターの1/10～1/30程度の発現をするCMVΔ130
プロモーターを開発し
実用化しております。
３ テトラサイクリンによる発現誘導技術
タンパク質の中には 微量であっても強制発現させると細胞の増殖を阻害して細胞樹立は難しくなるもの
があります。このような場合 通常は発現を極力抑え、必要なときにテトラサイクリンで発現誘導の
できる発現コントラクトを Flp-Inの系で細胞に１コピー導入し まず増殖させた上で テトラサイクリン
による誘導発現させることで 相互作用タンパク質を同定するシステムを作り 実用化しました。
（ライセンス保有）当社は TET System GmbH & Co. からテトラサイクリンによる発現誘導に関わる
TETライセンス（Licensee Number ;162）を受けております。
テトラサイクリン誘導発現技術の利用によってご依頼の細胞が樹立出来た時 TET System GmbH & Co.
に対して ご依頼者から「NOTICE AND ACKNOWLEDGMENT」 の提出が必要となりますので ご承知ください。
（詳細は 改めて連絡させていただきます）
４ 定常発現が困難なタンパク質の一過性発現活用による複合体解析技術
以上のような技術を駆使しても タンパク質の性状から遺伝子の発現細胞の樹立がどうしても困難な場合
があります。そのようなタンパク質の相互作用タンパク質を得るため 定常低発現コントラストを用いて
一過性発現（transient expression)をさせ、免疫沈降を行い 複合体を決定します。
タンパク質発現細胞樹立に関する注意事項
１ 細胞樹立は 予想されるサイズにタグ抗体が結合するタンパク質が発現した場合に
樹立できたものとします。
２ 使用する細胞はヒトHEK293に限定しておりますので、特定の細胞、例えば神経細胞、
にのみ発現している タンパク質の複合体は解析できません。
３ タンパク質を少しでも強制発現すると細胞毒性の現れる遺伝子は、テトラサイクリン
による誘導発現系を用いても、非誘導状態 でわずかにタンパク質が作られているので
細胞樹立が出来ない場合があります。
４ 複合体決定の細胞を特定の条件で培養する事が可能です。 例えば、ストレス応答の
複合体を決める為に細胞に化学的や物理的なストレスを加えて、ストレスを加える前
の複合体と比較する事等です。
特定条件での培養を含む追加費用は 個別の条件に応じて 見積もらせていただきます。
ご相談ください。
ご注文の手順
１）メールの送信
誘導発現ヒト細胞樹立と相互作用タンパク質の同定サービスをご照会またはご注文いただくとき
メールをご送信ください。
送信先メールアドレス pro@jbios.co.jp
|
メールで連絡していただきたい事項 １ ご注文者（研究機関名、所属、氏名、住所、電話番号、メールアドレス） ２ サポートを希望される内容（ご希望を記入ください） ３ ご送付いただく cDNA及びベクターに関する情報 |
２）メールの返信 ご照会またはご依頼いただきましたメールの内容に応じて解析手法に関して当社
での検討を行います。必要に応じて打ち合わせをさせていただいた上で解析の諾否を連絡させて
いただきます。
３）cDNAの送付方法
お手元のcDNAをお送りください。
送付いただくcDNA（量は10 マイクログラム程度必要）は 大腸菌ではなく cDNAの入った
プラズミドをお送りください。
サンプルをクール便（4℃、着払い）で下記の住所までお送りください。
サンプル送付先：
〒９８０－８５７９宮城県仙台市青葉区荒巻字青葉６－６－４０
株式会社日本プロテオミクス 宛
電話 ０２２ー３４２－１７４２
発送していただきましたら、メールにてお知らせください。
トラブルを避けるため 平日の着荷でお願いいたします。
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