DNA RNA の受託合成、プロテオーム受託解析、ペプチド抗体作製
　バイオ研究を支援する

免疫沈降法 (具体的なプロトコール)　　　　　　　　　　　　　　

ここでは、FLAGタグを付けたタンパク質X の安定発現細胞株を用いた実験方法をご紹介します。


１．細胞の破砕と分画

　　1) 回収した細胞（FLAGタグ付きXを発現させた細胞、及び コントロール用に FLAGタグのみを発現させた細胞、
　　　 15 cm dish、各２-４枚）を SHE緩衝液（*a)で一度洗浄し、遠心してペレットにします。
　　　　 　＊a　SHE緩衝液組成
　　　　　　　　　　10 mM HEPES (pH7.5) / 210 mM mannitol, 70 mM sucrose, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0.15 mM spermine,
　　　　　　　　　　0.75 mM spermidine

　　2) １）のペレットに SHE緩衝液を 3-4 mL 加え、ポッター型ホモジナイザーを用いて細胞を破砕します。
　　　 (ストローク数 : 10-20回程度)

　　3) 破砕した細胞を 遠心 (3,000 x g 、10分間) し、上清（粗細胞質画分）とペレット(粗核画分)に分けます。

　　4) 粗核画分のペレットを 1回洗浄（SHE緩衝液を加えて再懸濁、遠心し、上清を除去）した後、NE緩衝液(*b)を
　　　 3-4 mL 加え、ポッター型ホモジナイザーか超音波破砕機を用いて再懸濁させ、氷上で 10分間置いた後
　　　 10,000 x g 以上で 15分間 遠心し、上清を回収します。
　　　 粗細胞質画分（3)の上清）も、同様に、10,000 x g 以上で15分間 遠心し、上清を回収します。
　　　　　　　 ＊b　NE緩衝液組成
　　　　　　　　　　50 mM HEPES (pH7.5) / 0.35 M NaCl, 0.1 % NP-40, Protease Inhibitor cocktail

　　5) 4)で回収した細胞エキストラクト（核、細胞質）に、それぞれ RNase I (10 mg/mL)、 DNase I
　　　 (10 mg/mL)、Benzonase (50 U/mL) を加え、タンパク質低吸着性フィルター（Φ0.45 μm）で濾過します。

２．細胞エキストラクトと抗体ビーズのインキュベーション

　　予め、1.5 mL チューブに抗体ビーズ（ここでは Sigma の ANTI-FLAG-M2 agarose 50 uL）を分注しておき、
　　１．で準備した細胞エキストラクト（核、細胞質）を それぞれ 1-1.5 mL 加え、ローテーターを用いて、
　　4 ℃で 3-4 時間インキュベーションします。(オーバーナイトでのインキュベーションは避けます。)


３．抗体ビーズの洗浄

　　1) インキュベーション後、遠心（1,000 xg、2 分間）して 上清を除き、0.15 M NaCl 洗浄緩衝液(*c)を加え、
　　　 洗浄（チューブを 3-4 回インバートした後、遠心（1,000 xg、2 分間）し、上清を除去）します。
　　　　　　　 ＊c　0.15 M NaCl 洗浄緩衝液組成
　　　　　　　　　　50 mM HEPES (pH7.5) / 0.15 M NaCl, 0.1 % NP-40

　　2) 0.3 M NaCl 洗浄緩衝液(*d)を加えて、1)と同様に洗浄します。
　　　　　　　 ＊d　0.3 M NaCl 洗浄緩衝液組成
　　　　　　　　　　50 mM HEPES (pH7.5) / 0.3 M NaCl, 0.1 % NP-40

　　3) 0.3 M NaCl 洗浄緩衝液を加え、ローテーターを用いて 4 ℃ で 10 分間インキュベーションします。

　　4) インキュベーション後、遠心（1,000 xg、2 分間）して 上清を除き、PBSを加えて、1)と同様に洗浄します。　　　

　　5) 上清を除去後、高速遠心し、十分に上清を除きます。

４．溶出、SDS-PAGE

　　抗原ペプチド（ここでは FLAGペプチド (500 ug/mL in HEPES buffer)を 60 uL）を加え、室温で 10 分間
　　インキュベーション後、高速で遠心し、上清を回収します。
　　抗体ビーズの混入を避けるため、回収した溶出液を、再度、高速遠心して上清を回収し、SDS-PAGEを行い、
　　コントロールとの比較により、タンパク質X の相互作用タンパク質のバンドを確認します。
　　

免疫沈降のコツ

＜細胞エキストラクトの調製＞

　●細胞の破砕と分画
　　細胞や臓器の破砕用緩衝液は、等張で 膜を保護する組成のものを使用します。具体的なプロトコール（上記）で
　　示した SHE緩衝液には、マイナスにチャージした膜表面を安定化し、核やミトコンドリアを保護する為に、ポリ
　　アミンが含まれています。
　　また、微量にしか存在しない相互作用タンパク質を同定する為には、total cell lysate を用いるよりも、粗分画
　　したエキストラクト（細胞質、核、ミトコンドリア画分など）を用いた方がクリアな結果が期待できます。

　●DNase、RNase の使用
　　RNA結合タンパク質（ribosomal protein、RNAスプライシング因子など）や、DNA結合タンパク質（Ku70、
　　Ku80、DNA PKcs など）は、RNA や DNA の存在によって非特異的に抗体ビーズに吸着します。
　　それを防ぐために、細胞エキストラクトの調製段階で、DNase、RNase を添加することをお勧めします。
　

　●タンパク質低吸着性フィルターの使用
　　細胞エキストラクト調製の過程でミセル化した膜や、混在する細胞の破片も、非特異的に抗体ビーズに吸着し、
　　免疫沈降に影響を及ぼすことから、それらを除去する為に、タンパク質低吸着性フィルター（≦Φ0.45 μm）
　　による濾過をお勧めします。

　　

＜インキュベーション＞

　●インキュベーション時間
　　抗原と抗体の結合は早くて強い為、数時間のインキュベーションで充分結合します。非特異的な吸着を避ける
　　ために、インキュベーション時間は、長くても「4時間以内」にすることをお勧めします。

＜抗体ビーズの洗浄＞

　●塩、界面活性剤の使用
　　生理的に重要な「相互作用タンパク質」は、タンパク質同士が立体的に密着しています。
　　その為、外界の溶媒の影響を受けにくく、0.6 M の NaCl を含む洗浄液で洗浄しても外れないことが多いので、
　　非特異的に吸着しているタンパク質を洗い流すために、0.3-0.5 M NaCl、0.1-0.5 % 界面活性剤を含む洗浄液で
　　十分洗浄することをお勧めします。

　●緩衝液の変更
　　塩や界面活性剤の組成だけではなく、緩衝液の変更によっても洗浄効果が期待できます。
　　例えば、HEPES から リン酸緩衝液、Tris-HCl から リン酸緩衝液へ変更することで、洗浄効果が上がります。

＜溶出 とSDS-PAGE＞

　●溶出液の濃度
　　液量を増やさずに、目的の相互作用タンパク質を十分に溶出させるために、溶出液の濃度（FLAGタグの場合、　
　　FLAGペプチドの濃度）を、マニュアルに記載されている濃度よりも、少し高めにすることをお勧めします。

　●抗体ビーズ
　　溶出液（最終）中に抗体ビーズが混入しないよう、注意してください。

　●SDS-PAGE
　　ケラチン汚染を極力防ぐため、用時調製（あるいは 質量分析用にストック）した サンプルバッファーの使用を
　　お勧めします。

実験の成功を祈ります。