DNA RNA の受託合成、プロテオーム受託解析、ペプチド抗体作製
　バイオ研究を支援する

ペプチド抗体精製キット マニュアル

１．用意するもの

　　・溶媒１：1X PBS
　　・溶媒２：1X PBS with 0.1 % Tween 20
　　・溶媒３：0.1M Glycine (pH 2)
　　・溶媒４：1M Tris-HCl (pH 8)
　　・溶媒５：1X PBS with 0.02 % NaN₃
　　・精製抗体回収用チューブ

　　・エンプティカラム　　　　　　　　＜キット添付品＞
　　・抗原固定化セファロース（１ｍｌ）＜キット添付品 (5 mL チューブ内)＞



２．方法

　　(1) 血清の準備
　　　　血清を 溶媒１で 2倍希釈します。

　　(2) インキュベーション
　　　　5 mL チューブ中の 抗原固定化セファロース と (1) の希釈した血清を混合し、37℃ で 1時間振とうさせた後、
　　　　4℃ で 8時間置きます。

　　(3) カラムへの充填
　　　　エンプティカラムをカラムスタンド等に固定し、カラムの下端が密閉されていることを確認した上で、
　　　　(2)の抗原固定化セファロースと血清の混合体を充填します。

　　(4) 非吸着画分の溶出
　　　　カラムの下端を開き、非吸着画分を溶出させ、チューブに保存します。

　　(5) カラムの洗浄
　　　　カラムを溶媒２（15 mL）で洗浄後、溶媒１（30 mL）で洗浄します。
　　　　※洗浄後、洗浄液の 280 nm における吸光度（A₂₈₀）を確認し、 0.002 以上の場合、溶媒１で再洗浄してください。

　　(6) 抗体回収用チューブの準備
　　　　チューブラックに　6〜8 本の回収用チューブを用意し、各チューブに 溶媒４を 200 uL 入れておきます。

　　(7) 抗体の溶出
　　　　カラムに 溶媒３を 5 mL 加え、溶出液を 1 mL ずつ チューブに回収します。
　　　　回収した溶出液（各チューブ）の吸光度（A₂₈₀）を測定し、抗体の含まれている画分をプールします。
　　　　

　　(8) 抗体の濃度計算
　　　　プールした精製抗体の吸光度（A₂₈₀）を測定し、次の公式から濃度を算出します。

　　　　濃度（ug/mL）= A₂₈₀ (1/LP) ×0.69× 1000　　※LP：光路長（cm）

　　(9) カラムの再生
　　　　カラムを溶媒５（10 mL）で洗浄し、洗浄液が pH７であることを確認します。
　　　　4℃で保存します。
　　　　（抗原固定化セファロースは、溶媒１の10倍希釈液とともにチューブに保管します）